《中国药典》版、版纯化水微生物限度检查中要求使用薄膜过滤法进行检查1-2,但未对薄膜过滤法的检测量等进行明确规定。目前常被采用薄膜过滤法检验量1mL。已有研究表明，薄膜过滤法1mL和平板计数法1mL两种方法的检测结果-致,无明显差异),可见采用1mL检验量并不能体现薄膜过滤法的优势。故薄膜过滤法1mL的检测方法符合性、严谨性不够。

《欧洲药典》、《美国药典)》6和英国药典)8-)对纯化水检测方法有不同的规定和侧重点。目前,大部分出口欧美市场的制药企业，均会按照目标出口国的国家药典要求进行纯化水检测,但对于这些检测方法的样品检验量,国内未见研究"。本试验在分析~年三个年度纯化水微生物限度检测报告的基础上，拟以自制纯化水为研究对象,基于中国和欧美药典的方法,对比研究了不同方法和培养基的检测效果,明确了最佳检验量,同时明确了更灵敏的培养基，建立了更科学的纯化水检测方法。该方法的建立对于提高纯化水微生物限度检查的有效性、真实性和简便性具有重要的现实意义,并与国际标准接轨。

1材料和设备

1.1材料纯化水

1.2试剂及培养基

氯化钠;磷酸二氢钾;磷酸氢二钠;蛋白胨培养基;营养琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;平板计数琼脂培养基;酵母蛋白胨葡萄糖琼脂培养基。

1.3设备NAI-STV3A型薄膜过滤器(那艾仪器),脉动真空蒸汽灭菌器,干热灭菌烘箱,pH计,P电子天平,垂直净化工作台,恒温培养箱。

2实验方法

2.1检验量的对比研究

分别取1mL和10mL的纯化水,采用《中国药典》年版(CP)四部中的薄膜过滤法进行其微生物限度检查"”。取少量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液注人过滤杯中，以湿润滤膜。湿润滤膜后取10mL或1mL纯化水样及20~30mL的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,过滤,取出滤膜,薄膜菌面朝上，分别置于营养琼脂培养基和玫瑰红钠营养琼脂培养基表面,细菌35C,培养3d,霉菌/酵母菌23C,培养5d2(作者已按照企业操作规程对该方法进行方法学验证)。菌落计数器计数。

2.2培养基检测效力的对比研究

采用《美国药典》USP--38(USP38)、《欧洲药典)EP7.0(EP7.0).《英国药典》BP(BP)和CP中规定的薄膜过滤法9.6.周,设定检测量为10mL,分别使用营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、平板计数琼脂培养基PCA和R2A培养基进行检测培养。具体操作方法同“2.1”项下方法,取滤过后薄膜,分别置于营养琼脂培养基、玫瑰红钠营养琼脂培养基.平板计数培养基和R2A琼脂培养基的平板表面进行培养计数。

3.1检验量对比研究的实验结果

不同检测量的纯化水微生物检测结果见表1。通过实验可以看出,对于1mL检验量的薄膜过滤法,19个水点的微生物限度质量均良好,只有2个水点检测出微生物污染,且菌落数少,检出率低(2/19),未发现任何不良趋势。对于10mL检验量的薄膜过滤法,菌体检出率较高(7/19),是1mL检验量时菌体检出率的3.5倍,5、10.15.18和19号水点均反映轻微微生物侵染,能够更好地反映纯化水的微生物限度情况。13号水点微生物污染程度接近警戒线，便于发现不良趋势,及时采取针对纯化水系统清洁维护的整改措施。可见,薄膜过滤法具有较好的集菌效果,10mL的纯化水检测量适合于纯化水的微生物限度检查,样本代表性较好,菌体检出率高,能够更加准确和真实地反映纯化水质量,保证纯化水系统的持续、稳定、有效运行。

实验中发现使用营养琼脂和玫瑰红钠琼脂培养基的培养效果与使用PCA培养基的培养效果基本一致,可能只检出了水样含菌总数的一部分,未能完全反映水样中微生物的存在情况,这与顾孔珍等川"的报道-致。R2A培养基属于低营养类培养基,其营养成分较广泛,能促进受损细菌的恢复性再生长,更适用于纯化水的检测。这将避免由于培养基灵敏度不够而造成的纯化水质量不良趋势无法被发现的情况,能够及时准确地反映纯化水系统运行情况，及时维护，延长系统寿命。

本文研究所确定的方法可大大提高纯化水微生物限度检测的有效性,有利于生产和检验中纯化水质量的控制。同时,也为其他制药企业建立合适的纯化水微生物限度法提供参考和指导。