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ELISA全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)，是当前应用最为广泛的一项定性、定量检测抗体（抗原）的免疫酶技术。

过程示意图（图1）

一、基本原理

ELISA是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。固定在载体表面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性。酶标记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性。在实际检测时，首先将抗原或者抗体固定在固相载体上。然后加入检测对象，让待测物质与固相化物质结合，形成固相化的“抗原—抗体”复合物。再加入酶标记的抗体或者抗原，与固相化的复合物结合，形成酶标复合物。最后加入底物溶液，发生酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定量分析。

了解完原理后，接下来让我们来认识一下ELISA大家庭中的主要成员吧！

说到家庭，首先要认识一下居住环境，也就是大房子，ELISA家庭的大房子可是精装修呢，我们把它命名为固相载体。

固相载体在ELISA实验中作为吸附剂和容器，最常用的材料是聚苯乙烯，它能较强吸附蛋白，可用于吸附抗体（原）且仍能保留其原有的免疫学特性。

成员一

包被用的抗原（体）,进行ELISA反应的第一步就是将抗原（体）固定在固相载体上，是通过抗原（体）自身结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团之间的引力结合完成的。然而，它们之间的结合可不止这么简单，还会受到抗原（体）浓度、包被温度，包被时间，PH等的影响。

成员二

酶标抗体（原），它是ELISA中关键试剂之一，既要求有酶催化活性，又能保持了抗体（原）的免疫活性，当遇到相应的底物时，可以催化底物反应生成有色产物，作为我们进行结果分析的重要依据。

成员三

洗涤液，在整个ELISA的实验中，需要进行多次洗涤，避免引起非特异吸附，要想保证能达成我们的最终“目标”，洗涤液可是必不可少的一个成员。

成员四

终止液，光听这个名字大家也就清楚它的功能了，就是终止反应，也就是站好我们这个ELISA大家庭的最后一班岗。

就像每个家庭一样，成员间配合模式也是不同的，根据不同的配合模式，主要可分为四种类型，每一种类型各有优缺点，下面为大家详细介绍。

01

间接ELISA

间接法常用于检测抗体，将抗原固定于固相载体上，首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色，通过颜色深浅(酶标仪)进行结果判读。

优点：只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，目前使用较为广泛。

缺点：存在交叉反应的可能性，抗原纯度不够会导致非特异结合，产生假阳性。

间接法示意图（图2）

02

竞争ELISA

竞争ELISA既可用于检测抗体，也可用于检测抗原。以检测抗体为例，将抗原固定在固相载体上，首先加入待检抗体，再加入酶标抗体，则待检抗体就与酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉未被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。

优点：可用于检测不纯的样品，且数据再现性高，特异性好。

缺点：操作方法更复杂一些，产品性能取决于抗体的亲和力。

竞争法示意图（图）

0

双抗体夹心ELISA

此方法常用于检测抗原，将抗体固定在固相载体上，首先加入待测抗原与抗体特异性结合，随后加入酶标抗体检测并利用底物显色。

优点：抗原无须事先纯化，进行操作时不需稀释。

缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

双抗夹心法示意图(图4)

04

双抗原夹心ELISA

反应模式与双抗体夹心法类似。将固相抗原和酶标特异性抗原分别取代固相抗体和酶标特异性抗体，就可用双抗原夹心法测定样品中的抗体。

优点：该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，受检抗体不需要稀释。

缺点：技术难度较高，需要制备高质量的酶标抗原。

双抗夹心法示意图（图5）

相信大家现在已经了解了ELISA的基本原理及方法学了，也想必大家有藏着一个小疑问，ELISA家族都是用来检测抗体（原），但是又有哪些指标评估ELISA试剂盒的质量呢?

01

特异性

特异性简单来说就是阴性样本的阴性检出率，要保证这一点首先就需要做到与其他检测抗体（原）无交叉感染，并且保证阴性样本检出的准确性。

02

灵敏度

灵敏度简单来说就是阳性样本的阳性检出率，一方面能够反映出试剂盒对于被检物质的最低检测能力，另一方面需要保证阳性样本检出的准确性。可通过我们自身待检物质的性质进行选择，如果我们待检物质浓度量很低，可以选择高灵敏的试剂。

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精密性

又可称作重复性，一般而言，对于ELISA试剂盒而言，板间及板内精密性可控制在15%以内。有些ELISA试剂盒精密性可达到10%以内。

04

稳定性

稳定性是试剂盒必须有的基本属性，是指试剂（盒）在有效期内和规定条件下保持其性能的能力，一般有效期稳定性、运输稳定性、以及冻融稳定性。

05

操作简便性

同样对于ELISA的操作简便程度大家也是非常关心的，操作时间以及操作步骤也是我们在选择试剂盒过程中需要考虑的问题。

二、取材方法及注意事项

a、液体样本液体样本处理原则：所有的液体样本，用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），如果以后遇到其他的液体样本，也按这个方法，纳入汇总表。

1、血清：用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20分钟，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

、尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4、胸腹水：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5、脑脊液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6、唾液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

7、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8、牛奶：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

9、蜂蜜：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。10、全血：用含有抗凝剂的无菌管收集，立即轻轻摇动，来回轻轻颠倒数次，使血液和抗凝剂混匀，以防血液凝固。

b、固体样本固体样本处理原则：称取1g的固体样本，用9g的合适缓冲液溶解，分泌蛋白可以直接离心取上清检测，细胞内的蛋白，要先收集细胞，再用合适方法破碎，离心取上清测试。

1、组织标本：切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。对于植物组织，不好匀浆的话，就在液氮中充分研磨；

2、细胞内蛋白样本许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。（1）培养的细胞A、动物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到万/ml左右。通过反复冻融（如果反复冻融，破碎效果不好，就采用超声波破碎），以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。B、植物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到万/ml左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎2s，冷却0s的方式，充分破碎细胞，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。（2）组织的细胞切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

、土壤：称取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子头部，摇匀，用镊子取出咽拭子并挤干液体，2-8℃条件离心20分钟左右（-转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

5.植物标本的精采集及保存1、称取0.1g（误差±%以内）新鲜植物组织样本，在液氮中充分研磨；2、加入1ml的提取液（80%甲醇）,置于-20度过夜；、于4度，8rpm，离心1小时，取上清；4、上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱上样收集样品移开样品后用%甲醇（5ml）洗柱%乙醚（5ml）洗柱%甲醇（5ml）洗柱循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干，保存备用；5、上样前加入pH7.4PBS缓冲液（1ml定容）。混匀后室温放置0分钟，然后4度离心（8rpm，15分钟），取上清并暂时保存于4度待用。

c.植物标本中相关酶或蛋白的测定：（粗提取）

1、新鲜植物组织请在液氮中充分研磨；

2、加入样品体积9倍的提取液（pH7.4PBS缓冲液）；

、请于4度，8rpm，离心0分钟，取上清并暂时保存于4度待用。

三、样本收集注意事项

1、不能检测含NaN的样品，因NaN抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。2、标本采集后尽快进行实验，若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

、我们罗列的是通用的样本处理方法，无法涵盖各种样本，对于一些特殊样本，建议实验人员多参考已发表的文献，自行设计合理的样本处理方法。

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