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内毒素检测细胞内毒素凝胶法飞凡检测张同

发布时间:2023/2/21 15:55:13   
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内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖(LPS)。它是一种典型的热原,哪怕是皮克级(10-12g)或纳克级的(10-9g)内毒素进入血液,也会引发各种生物反应。因为其有着耐热性和稳定性,通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活,需在℃或以上的温度下,干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中(例如水,空气),即使在细菌死亡后,细菌性的内毒素(LPS)仍然存在。

  图1为脂多糖的结构图,如图所示,脂质A在该物质中是负责生物活性的主要部分,这部分的分子量约为。包含糖链部分在内的整个分子的分子量一般为到左右。然而,因为内毒素是一种同时拥有亲水区(糖链)和疏水区(脂质A)的分子,它能在水溶液中相互缔合,形成表观分子量为数十至数百万的胶束结构。有报告指出,胶束结构的变化,会影响其生物活性的强弱。

  图2所示为大肠杆菌型和沙门氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样,脂质A的基本结构在大体上仍然相同。

图1.脂多糖(LPS)结构示意图

图2.脂质A的结构(大肠杆菌型和沙门氏菌型)

由马蹄蟹(美洲鲎)的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示,在内毒素的参与下,级联反应开始进行,其中C因子,一种丝氨酸蛋白酶前体,最先被活化。随后接下来的是B因子的活化,B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体,它能将凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝胶。在LAL测试中,内毒素可以通过三种方式定量:对凝胶的形成进行测定,对浊度的增加进行测定,或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。

  普通的LAL试剂不仅与内毒素反应,而且会与(1→3)-β-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分)反应,因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种(1→3)-β-D-葡聚糖活化,在工业中通过去除G因子或抑制其活化,开发了各种内毒素特异性试剂。

  市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此,根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择最合适的产品是十分重要的。

美国,欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法,分别是凝胶法、比色法和比浊法,我们会在下面的章节中详述,并且会介绍相关的LAL试剂的特点以及其应用实例。

(1)凝胶法

  将样本与LAL试剂在试管中混合,并使用干浴器,在37±1°C下,孵育60±2min,期间不要振动。加热完成后,立即缓慢地将试管倾斜°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷,则结果可确定为阳性,而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间,对于一系列样本,要进行多倍稀释(通常为2倍),以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。

相关试剂

  在单次型试剂盒和多次型试剂盒中都包含LAL试剂,其中单次型试剂盒中的反应小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂,而多次型试剂盒则是将所需量的已经溶解好的LAL试剂装入到反应瓶中。单次型试剂盒非常适用于少量样品的检测,而多次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。

  多次型试剂盒的使用方法式是将0.1mL已经溶解好的LAL试剂分装到反应管中,然后再加入0.1mL样品,并将其混合。而单次型试剂盒的使用方法则是将0.2mL样本加入到含有预先分装好的LAL冻干试剂的反应小瓶中。

ES-II系列

特异性内毒素LAL试剂(不会被(1→3)-β-D-葡聚糖活化),与细菌内毒素检测(BET)(日本药典)相兼容。其胶凝灵敏度为0.EU/mL,单次型和多次型试剂盒均有提供。

(2)比色法

  由于内毒素会使LAL试剂活化,比色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基#苯*胺的黄色的吸光度是在nm波长下检测的,如果样品在约nm波长下具有相当大的光吸收,则不宜使用比色法。

相关试剂

ColorKY系列

  内毒素特异性比色法LAL试剂,与BET(日本药典)一致性测试相兼容。与Toxinometer结合使用的单次型试剂盒,以及与酶标仪和Toxinometer结合使用的多次型试剂盒,可用于动态比色测试。这些系列在我们的试剂产品有着最高的灵敏度:检测限为0.EU/mL(单次型)和0.EU/mL(多次型)。

(3)比浊法

  比浊法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。

相关试剂

ES-F系列和ES-II系列

  在动态比浊法测量中,可以将ES-F系列、ES-II系列与酶标仪和Toxinometer结合使用。这些试剂盒不仅能获得凝胶法的结果,同时能得到动态比浊法的数据,测量时间为60min。



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