李庆超（山东师范大学）8月25日，北京中国科学院大学奥运村校区校园内环境监测样本中发现一处点位为新冠病毒阳性，临时封闭，全员核酸检测后，未发现人员阳性。不久，校园重新开放。幸好，这只是一场虚惊。这种在环境样本监测中发现阳性样本，但最后判定并非“真污染”的情况，类似于核酸检测实验室中发生的假阳性现象。当前，“人物同防”已成为我国疫情防控的重点，环境新冠核酸监测是常态化防控中不可或缺的环节。但是，环境监测屡屡出现“假阳性”，给疫情防控带来了困扰。环境中的核酸污染来源很多。今天，我们主要讲讲病毒基因扩增（如在核酸检测中）等操作可能带来的污染应怎样防控。同时，也要问问，完全清除环境监测中的假阳性，是否能做到？我们要先从核酸检测的原理讲起。1病原体检测病原特异性检测是最直接和有效的传染病诊断方法。它可以给出特定病原体存在或不存在的证据，一般来说有三种检测思路：①直接观测：直接观测病原体本体的存在。例如用染色或培养观察的方式来检测细菌，用电镜观察病毒。这种方法常用于诊断感染或发现新病毒。②组分检测：并不直接检测病原体本身，而是检测病原体所含的特异性物质，来判断其是否存在。比如，检测到新冠病毒的部分特异性核酸序列，就能证明人体内存在新冠病毒。现在我们做的核酸检测，就是采用组份检测的思路。③感染后果检测：通过检测病原体感染宿主造成的特异性后果来间接检测病原体的存在，例如某些特征性的损伤或病理反应，及免疫反应产生的特异性抗体引发的血清学现象等等。临床中常用的方法是检测病原体的特异性抗体。这种方法操作简单、无需特殊仪器，但是存在窗口期，仅能证明某人接触过病原体抗原（可能是自然感染、也可能是疫苗注射）并产生了抗体，但不能知道体内是否有病原体。2核酸检测核酸检测的本质是特异性引物指导下的特异性序列扩增和检测，具有极高的灵敏性。它的原理是：1）设计使用特异性的核酸探针，2）该探针可以根据碱基互补配对原则来结合特异性的病毒序列，3）并在聚合酶的帮助下进行DNA延伸扩增，4）在荧光物质的帮助下，5）通过检测DNA扩增的结果来判断是否存在特异性的病毒序列，从而证明是否存在病毒。其中非常重要的因素是特异性引物和模板。世间生灵百态，都使用核酸（主要为DNA，RNA病毒为RNA）作为遗传物质。遗传信息就储藏在长长的核酸分子的碱基（DNA为A、T、C、G；RNA为A、U、C、G）的排序中。而你、我的差异，你我与病毒的差异都写在这些由碱基序列组成的遗传信息中。病毒遗传信息，也就是核酸碱基序列（模板）的存在，就可证明病毒的存在。探针或引物是一段短的（长度通常在20个碱基左右）单链脱氧核糖核酸。可以根据碱基互补配对原则（C≡G、A=T或A=U），与其它核酸链进行配对。引物或探针的设计是检测特异性病毒序列的关键，要在待检测病毒独有的序列上进行设计。我们以20个碱基特定序列为例，随机产生此序列大概需要4^20次方的随机DNA序列（数据容量为1TB，而人类基因组信息约为3GB），再加上一对引物、并考虑扩增长度的限制，基本能够达到特异性检测的目的。与模板互补配对后，引物在DNA聚合酶的帮助下来合成DNA。而合成后的DNA又可以作为模板供下一轮引物结合，和DNA合成，如此一来，特定的DNA片段可以指数级的扩增，新产生的DNA链可在有限的循环内（一般为35-40）达到很高的量，足以被检测。这种神奇的技术就是聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR），而能够实时监测扩增量的PCR称为荧光定量PCR（qPCR），后者是实验室最常用的病毒核酸检测方法。图1.PCR的基本原理。红色的为引物，绿色的为核苷酸及新生链，蓝色的为模板链。引物以碱基配对的方式特异性识别模板，并在聚合酶（黑色）的帮助下进行延伸，经过数次变性（拆开模板DNA双链）、退火（引物与模板DNA单链结合）、延伸（酶催化产生新生链）的热循环，特定DNA片段成指数增加。（点开看大图）3怎样预防假阴性和假阳性？检测实验的关键有两个，一个是灵敏性、一个是特异性。通俗的说，灵敏性是指样品里“有”（阳性），检测结果证明为“有”（阳性）的能力；而特异性，是指样品里“没有”（阴性），检测结果证明为“无”的（阴性）能力。检测实验害怕的结果也有两个，一个是假阳性，一个是假阴性。假阳性是指，本来没有，检测说是有；假阴性是指本来有，检测说没有。一把宝剑，最锋利处，恰是其最脆弱之处。PCR技术具有极高的灵敏性，同时也导致其极易产生假阳性。PCR或qPCR检测的假阳性往往是由以往的PCR扩增产生的产物污染后续试验样本或检测体系造成的，因为PCR扩增产物是同一对引物完美的模板。这是核酸检测实验室需要千方百计避免的恶梦。1.合理的实验室设计根据卫生部年颁布的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》，一个合格的临床基因扩增检验实验室需要设置四个隔开的工作区域：试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、分装和扩增反应混合液的配制（最好在超净工作台中进行）标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取（视样品情况可在生物安全柜中操作）、贮存及其加入至扩增反应管；扩增区：DNA和cDNA的扩增及检测（定量PCR分析），巢式PCR测定的第二次加样必须在扩增区进行扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定（全自动核酸扩增仪，如定量PCR仪时，产物分析区可以和扩增区合并）进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，通过传递窗传递样品，气流方向也要按照单一流向，要从洁净区到污染区，可按照上述隔间顺序空气压力递减的方式进行，防止扩增产物随气流进入上游区域。其中标本制备区可设立正压条件（制备区气压高于其他地区，外部空气无法流入正压区），避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。扩增区和扩增产物分析区是产生PCR产物气溶胶的主要区域，所以可设立负压条件（指该区气压低于外部，区域内的空气无法流到外面），避免气溶胶外泄。基因扩增实验室通常用实验室的相对正压或负压来控制气流，如安装排风扇、负压排风装置、空调通风系统等，最好采用全送全排方式，条件和空间允许的话，每个区域可设定缓冲区。图2.实验室设计示意图。来源

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