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校准曲线是用于描述待测物质的浓度或量与相应的测量仪器的响应量或其他指示量之间定量关系的曲线,包括工作曲线和标准曲线。如果基体效应对分析方法至关重要时,应使用含有与实际样品类似基体的标准溶液系列进行校准曲线的绘制。
通常,一条校准曲线须配制包括零浓度在内六个以上的标准系列浓度点的信号值。用扣除空白信号值的数据为纵坐标,浓度(或含量)为横坐标,在坐标纸上植点,即为散点图,通过各点绘出一条与各点距离最小的直线,即可得出校准曲线图。在得到满足要求的散点图后,进行线性回归处理,得曲线y=bx+a。
回归时,即使其相关系数r≥0.,也常有曲线不通过原点的情形,此时校准曲线和纵轴相交于原点外的某一点,形成校准曲线的截距。这主要在于实验过程中全程序波动反映在各浓度点上并不完全相同,就如空白实验的平行结果常有一定的波动一样,因而使标准曲线受到影响产生截距,此外,形成截距的原因,还包括在回归运算过程中尾数舍入的影响。
随机误差总是存在的,但如果存在显著的系统误差或者操作失误,测得的a值较大时,应找出原因后,重新绘制标准曲线。
绘制校准曲线时,需要对以下8个方面的问题特别注意:
1、校准曲线范围
校准曲线的浓度范围由最低浓度和最高浓度来决定。最低浓度的标样应在接近检测方法报告限的水平(最低定量限),最高浓度不宜引起残留效应。需要涵盖相应的待测样品的浓度范围,并需进行与待测样品完全相同的分析处理。
一般来说,校准曲线的线性范围即是最佳测定范围。最佳测定范围应小于方法的适用范围,对测量结果的精密度要求越高,相应的最佳测定范围越小,测定下限高于检出限越多。由于校准曲线只能在其线性范围内使用,因而既不能在高浓度端任意外推,也不能在低浓度端随意顺延。
2、校准点的个数
校准曲线的不同浓度校准标样设置数需要符合方法标准或者专业技术领域的技术指导原则要求,或者结合仪器性能、待测物浓度及精密度要求等因素来具体确定。通常情况下,实验室至少使用5个标样(除空白外)。
3、标样的要求
校准曲线的系列浓度校准标样的准确度和精密度需符合方法标准或者专业技术领域的技术指导原则要求。
4、校准标样回读
校准曲线系列浓度的校准标样的分析要合理放置在待测样本的分析批中,一般一个分析批开始和结束各分析一组校准曲线的不同浓度校准标样,或者至少一个校准曲线的中间浓度校准标样。
5、校准曲线的空白样
空白样品原则上需要与待测样品基体一致或者相似,如果不存在干扰或基质效应,也可以使用单一来源的空白样品。
6、母液的选择
校准曲线制作使用的标准物质需要确保满足分析方法的要求,首选有证标准物质,必要时要进行核查。如果没有合适的基体有证标准物质,应进行回收率研究或与标准参考方法进行比对。
7、储备液的制备
校准曲线的系列浓度校正样品的制备需采用不同的储备液或者储备物质制备,并且不能用于制备质控样品,以避免出现与方法分析性能无关的偏差。如果储备液或者固体标准物质的准确度和稳定性已得到验证,则可使用相同的储备液或者储备物质制备校准标样。
8、浓度分布
为保证准确测量,待测样品的浓度需要合理分布在校准曲线的浓度范围内,避免集中在校准曲线的一端,或者超出校准曲线范围,如出现上述情况,需要重新制作校准曲线,或者采取其他方式处理。
总之,要想绘制出合格的标准曲线并不容易,必须充分考虑各个方面的影响因素,进而对标准曲线的绘制实施质量控制,以得出更加理想的标准曲线,保证实际工作中数据的准确性和可靠性。