前言

炎症是机体对感染、刺激或其它伤害的反应，同时伴随着内皮细胞趋化因子的产生和粘附分子的表达，可导致大量中性白细胞浸润。新的抗炎症药物的发现可以对这些因子起到负调节作用、减轻组织损伤，提高的疗效。筛选这些治疗药物需要一种快速和灵敏的细胞因子定量检测平台。

MolecularDevicesSpectraMaxParadigm多功能微孔板检测平台是一个用户可升级的微孔板读板机，用户可在2分钟内完成功能升级。只要用户想要升级其检测功能，Alpha技术可以在任何时候加入系统中。

TheSpectraMaxParadigm平台用于快速定量细胞因子TNF-alpha，可高灵敏的筛选由蓝细菌产生TNF-alpha刺激的人类内皮细胞中的抗炎症代谢物。AlphaLISA是一种基于微珠的均相实验，以微孔板为载体研究分子间相互作用，可用于细胞因子定量和抗炎症蓝细菌部分的筛选，发掘新的治疗方法。与传统的ELISA方法相比，AlphaLISA可减少由于洗涤过程造成的细胞层损伤，得到更小的标准差和更准确的结果。

优势

用户可自行配置的微孔板检测平台

优异的速度和灵敏度

预设实验模板让您更快获得结果

TNF-alpha纯化和定量

第一步是获得纯化的TNF-alpha蛋白，可用于内皮细胞中炎症反应刺激测定。为了达到这个目的，人类细胞因子TNF-alpha表达于毕赤酵母中，可生产大量重组蛋白，这些蛋白不会产生干扰细胞测定的内毒素。

每升酵母培养物可纯化10-20mg生物活性蛋白。TheSpectraMaxParadigm平台通过使用AlphaLISA实验方法(图1)检测蛋白含量可低至皮摩尔水平。软件提供预设实验模板，包含优化过的读板机设置，能在仅仅两分钟内读完孔微孔板。

图1TNF标准曲线。在SpectraMaxParadigm平台上进行TNF-alpha定量可低至皮摩尔水平。检测窗范围达4个数量级。

促炎症因子检测

接下来，利用AlphaLISA实验来检测内皮细胞应答TNF-alpha刺激所产生的促炎症因子水平。人类肺微管内皮细胞(HLMVEC)经过上述纯化的人重组TNF-alpha刺激后，以诱导细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达。TNF-alpha孵育18h后，ICAM-1表达上调。ICAM-1表达水平利用AlphaLISA进行定量(图2A)。

内皮细胞被TNF-alpha或LPS刺激后分泌IL-8，一种潜在的中性白细胞化学诱导剂，它可渗入体内炎症组织。来源于内皮细胞分泌的IL-8的定量能够提供很多关于体外血管内皮细胞的促炎症状态方面的有用信息。使用AlphaLISA可对经刺激后的HL-MVEC细胞培养上清液进行IL-8分泌水平评价(图2B)。

图2ICAM-1和IL-8在HL-MVEC中上调。TNFalpha刺激18h后，使用AlphaLISA在SpectraMaxParadigm平台上检测HL-MVEC中的上调的ICAM-1(A)和IL-8(B)。

一种基于内皮细胞筛选的抗炎症化合物识别方法

蓝细菌也被称作蓝绿水藻，拥有显著的代谢多样化，它们中的有些如今已经有望作为治疗化合物且用于测试治疗炎症疾病。以上描述的方法用于筛选来源于蓝细菌的抗炎症化合物。用从蓝细菌中分离出的不同成分预处理HL-MVEC，然后再用0.4ng人类TNF-alpha进行刺激。18小时后，用AlphaLISA技术在SpectraMaxParadigm平台上检测出ICAM-1水平上调，并进一步分析分泌在细胞培养上清液中的IL-8。蓝细菌成分,6(图3)展示出ICAM-1的显著减少，表明了它的抗炎症活性。

图3抗炎症蓝细菌成分的筛选。使用AlphaLISA对TNF-alpha刺激的HL-MVEC中诱导ICAM-1上调的蓝细菌成分进行分析。成分,6可明显减少ICAM-1的产生。

这一成分同样展示出IL-8分泌明显降低(数据未展示)。此成分在进行AlphaLISA前已测试过细胞毒性，结果表明对健康细胞无害。

结论

SpectraMaxParadigm平台结合AlphaLISA提供了一个强有力的筛选工具，可在基于病理学相关的内皮细胞模型中发现新的治疗方案。高达孔微孔板检测能力的灵敏度和速度，再结合预先优化了的软件方案，让使用者可以进行更快更高效的检测，SpectraMaxParadigm平台将成为您使用Alpha技术筛选的更好选择。

感谢

我们诚挚的感谢IMC应用科学学院的MarenPlüger,AnitaEigner,MariaHirschler,LindaKotnik,KatrinFuchslueger,JuliaSchweiger,ChristophWiesner,AndreasEger,WolfgangSchütt,和HaraldHundsberger,Krems,Austria,以及捷克科学院的JiriKopecky，为我们慷慨提供这里的实验数据。

参考文献

1.Rasool,M.;Sabina,E.P.;Lavanya,B.BiolPharm,29(12),.2.Romay,C.;Armesto,J.;Remirez,D.;Gonzalez,R.;Ledon,N.;Garcia,I.InflammRes,47(1),36.[31]3.Prinsep,M.R.;Thomson,R.A.;West,M.L.;Wylie,B.L.JNatProd,59(8),.