年12月以来，湖北省武汉市突然爆发新型冠状病毒肺炎疫情，其疫情形势严峻，大有向各省市扩散蔓延之势。年1月10日，由上海、武汉、北京等地研究人员首次将新型冠状病毒（Novelcoronavirus,-nCOV）的初步基因组序列存放在公开的GenBank数据库中。年1月22日，国家基因组科学数据中心正式发布“新型冠状病毒资源库”。

面对疫情新挑战，我国体外诊断试剂研发企业以及监管机构反应迅速，年1月26日，国家药品监督管理局首次应急审批4家核酸检测试剂，截止年3月22日，国家药品监督管理局共批准新型冠状病毒检测试剂盒25个，以及4种检测仪器设备和1个软件。应急审批的试剂，设备在应用过程中，不断优化改进，在COVID-19确诊中起到了重要作用。随着疫情全球爆发和蔓延，年2月28日，WHO向SARS-COV-2体外诊断试剂制造商发出邀请，开放SARS-COV-2核酸检测试剂EUL通道，中国制造走向全世界。

SARS-COV-2体外诊断试剂在使用中出现临床医生热议的核酸检测“假阴性”和抗体检测“假阳性”的问题，国家卫生健康委临床检验中心李金明教授给出专业的解答。为此《临床实验室》杂志社记者采访了李金明教授，请他对SARS-COV-2试剂的应用近期的热点问题，答疑解惑。现将访谈记录刊登，期望对读者们有一定的启示和受益。

01记者问：为什么说-nCoV核酸检测是确诊新型冠状病毒感染的“金标准”？

李金明教授：新型冠状病毒感染肺炎，也称严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒-2（SARS-CoV-2），它与年的SARS冠状病毒（SARS-CoV）一样，内含由长约30kb（如全长nt，GenBank:MN.3）的单股正链RNA，属于冠状病毒β属。5’端为开放阅读框（openreadingframe，ORF）1a和1b，约占基因组全长2/3，编码聚合酶等非结构蛋白；3’端约占基因组1/3区域，编码刺突蛋白（spike,S）、小囊膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrane,M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）。其中，以S区变异最为显著。病毒基因组由6个主要的开放阅读框（ORFs）组成；ORF1ab的7个保守的复制酶区可用于病毒种分类，其与SARS-CoV有94.6%相同；引物探针设计主要集中在ORF1ab、N基因和E基因。

检测病原体核酸的最为常用的方法是实时荧光RT-PCR，SARA-CoV-2也不例外。目前也有一些等温扩增检测的方法和个别直接杂交的方法。但不管是什么方法，只要是检测病毒核酸，通常都需要引物和探针。新型冠状病毒总体与SARS冠状病毒相似度较高，接近80%，这与其他冠状病毒也具有一定的相似性，它与蝙蝠冠状病毒的核酸序列一致性最高，达95%以上。其约3万个碱基的不同区域与其他冠状病毒的相似性有所不同，而有些区域相似度高达90%以上，但为保证检测的特异性，核酸检测试剂必须选择相似度低的区域设计引物和探针，因此一旦检测到，即为“阳性”，证明有病毒亦即感染的存在。所以说，病毒核酸检测阳性可以作为新型冠状病毒感染确诊的金标准。

02记者问：-nCoV核酸检测会不会出现“假阳性”？

李金明教授：这个问题问得很好，大家自然也会想到这一点，即新冠病毒核酸检测就一定不会有假阳性吗?当然，从前面的引物和探针设计的原理看，从理论上是不应该有假阳性的，并且试剂在批准过程中，也经过了分析特异性的性能确认（validation），所以，从方法学上看，是不会有假阳性的。但实际工作中，还是有可能出现检测的“假阳性”，通常是由于实验室检测人员操作时，发生了标本间交叉污染（cross-contamination）或实验室扩增产物的遗留污染（carry-over）所致。一个临床实验室如果严格执行“三个阴性样本随机放在临床样本中间同时参与检测全过程”的质控策略，应可有效避免病毒核酸检测假阳性结果的报出，这也是病毒核酸检测阳性可以作为新冠病毒感染的确诊依据之所在。

03记者问：-nCoV核酸检测结果为阴性，可以作为判断患者未被感染的诊断依据吗？

李金明教授：这个问题问得也很好，既然病毒核酸检测阳性可作为患者确认的标准，那如果病毒核酸检测结果为“阴性”，是不是也可用来判断患者没有被感染病毒呢？答案是：不能。因为不管是什么样的病原体核酸检测，假阴性都是一种绝对的存在，也就是说一定会有假阴性。通常由下述原因所致：（1）患者体内病毒载量因素，也就是病毒在人体内的复制量尚未达到可以检测到的程度，所采集的标本中没有足够量可供用于检测的病毒；（2）所使用的病毒核酸检测试剂分析敏感性不够高；（3）实验室没有严格遵循基因扩增检验实验室的质量管理（合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系）；（4）样本质量因素，也就是样本的采集是否符合规范要求，其标本是否采集到了含有病毒的细胞。

04记者问：临床医生对-nCoV核酸检测的“假阴性”的概念与临床实验室层面上的“假阴性”概念有何不同？

李金明教授：网络上曾激烈讨论的临床医生反映强烈的核酸检测“假阴性”概念，往往指的是患者临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎，但新型冠状病毒核酸检测多次或始终为“阴性”。通俗地讲，就是临床医生从患者的临床症状、肺部影像学结果甚至流行病学史都支持为新型冠状病毒肺炎，但患者病毒核酸始终不见阳性，检测结果与临床不符。

但实验室层面上的“假阴性”概念则有所不同，其是指所采集的样本中的病毒含量高于所用检测试剂的检测限（亦称分析敏感性），但实验室却没有检出。

05记者问：那如何避免实验室检测层面上的“假阴性呢”？

李金明教授：首先是把好病毒核酸检测试剂入门关。简单地讲，就是选择试剂时要进行必要的至少对检测限（分析敏感性）和重复性等的性能验证（verification）,以及每批试剂应用前的质检；因为不同的试剂其检测限会有所不同，检测的靶标也不一样，结果判断标准也有所差异，实验室可通过检测限和重复性这个简单的但也是最能反映试剂的性能差异的验证过程，可以了解拟选择的几种（可选两到三种）试剂在上述各方面的差异，形成自己实验室最优的检测系统（人、机、料、法、环），建立具有可操作性的SOPs。但一个试剂盒，不管其有多么灵敏，分析敏感性都是有极限的，其通常是从采集的样本保存液（如2~3ml）中，取一部分（如ul）进行核酸提取，提取后，再取一部分（如5~20ul）进行检测。因此，在样本中捕获病毒，就像在一本百万字的书里寻找错别字，理论上说，即使只有一个错别字也可以被发现；但实际上，由于成本和时间等的限制，只能从中随机抽取10万或者20万字进行查找，如果错别字数较少，其就有可能不在被抽取的字数当中，因此不可能找到。同样的，所采集的样本中病毒数量低于一定程度，试剂也就无法检出。因此，从这个层面上看，病毒核酸检测的“假阴性”是无法完全避免的。

第二是做好室内质量控制，每批检测至少有一份弱阳性质控（通常可为检测限的3倍，其最能监控弱阳性样本是否能成功检出）和3份阴性质控（如生理盐水），随机放在临床标本中间参与从提取到扩增检测的全过程。有同道觉得3份阴性有点多，觉得不可行。之所以设3份阴性质控，最主要是因为这是新冠疫情中的病毒核酸检测，为实时监控实验室“污染”的存在，保证阳性结果的准确可靠，只有通过多份阴性质控才能最有效的监测“污染”的发生。此外，检验人员上岗前的操作培训、各种消除及防止污染的措施（每次实验后用10%次氯酸钠溶液擦拭实验台面、地面、试管架等；仪器设备的日常维护及清洁；良好的通风等）、仪器设备的定期校准等也是有效减少实验室层面上的“假阳性”和“假阴性”的有效措施。

06记者问：那又如何尽可能避免临床医生所

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