“生物膜与红锈的困扰及如何进行合规性诊治”系列专题第四篇

污染位置

生物膜在制药生产系统中是常见的一种微生物污染形式，常见于管路、O型圈、垫片、水系统、RO膜等处。这些位置一般能够提供水或者潮湿的环境，所以相比其他地方，更容易产生生物膜。

取样方法

目前关于生物膜的取样和检测，药典中并没有相应的方法，但是已经有很多的方法可以用于生物膜的取样。而且其中一部分方法已经被制药企业所采用，下面来详细介绍一下具体有哪些可以应用。

取样方法包括破坏性取样，如截取一段管路；表面棉签取样；间接性取样，如现场的表面分析等。不论采用何种方法进行取样，都要注意不要对系统造成额外的污染，并且要进行相应的风险评估。

检测分析方法

用于科研的生物膜检测方法有显微技术，如扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）；光谱，如红外光谱仪（FTIR）、X射线荧光光谱仪（XRF）和免疫学技术，如DNA探针。由于这些分析检测方法复杂，而且需要高精密仪器，所以主要用于研究领域，并不适用于实际的工业生产中。

在实际的生产过程中，最简单的方法就是在紫外线下目视观察或者染色后进行显微镜观察。由于生物膜中微生物中含有的一些蛋白类物质的分子结构在紫外光的照射下会产生荧光，所以容易观察到生物膜的存在。如果用染色方法，更容易在显微镜下观察到。常用的染色方法为革兰氏染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。通过这种方法在显微镜下可以直接观察到微生物，并能看出生物膜中存在的微生物是革兰氏阳性（G+）还是革兰氏阴性（G-）。

还有一种快速的检测方法就是用ATP检测来确认生物膜的存在，ATP（三磷酸腺苷）是所有生物的主要能量载体，稳定存在于动植物、微生物的细胞中，含量稳定，目前ATP检测的灵敏度也很高，并且能够快速得到检测结果。

图1扫描电镜下不锈钢表面的生物膜

生物膜的去除

去除生物膜的方法可以根据系统的复杂性和生物膜形成的严重性而变化。任何物理去除生物膜方法都应谨慎使用，因为不仅存在损坏表面的的风险，而且可能会导致腐蚀侵袭的风险，对于不锈钢而言，物理方式的去除，可能会导致不锈钢表面钝化膜的损伤，进而导致不锈钢的腐蚀，最常见的就是不锈钢表面腐蚀后生锈的现象。

热力灭活虽然是灭活生物膜的有效方法，但是与常规的消毒相比，该方法通常需要重复进行，并且还要延长提高温度的时间。为了减少系统内存在的浮游污染物和生物膜，虽然常用的方式为使用热水冲洗系统，但是众所周知，在去除生物膜方面并不是完全有效的。

化学消毒剂的使用被认为是可以有效控制生物膜的手段和方式。使用化学消毒剂是杀灭生物膜的一种方法，但会带来化学消毒剂残留在水系统中的风险。因此，应在化学消毒剂消毒后后进行检测，以确保在系统中的化学消毒剂被冲洗干净，并达到相应的残留可接受标准。化学消毒剂的理想作用方式是渗透进生物膜，并对生物膜内的微生物起到杀灭作用。冲洗过程中适当的速度有助于清除碎屑和化学物质。常用的化学消毒剂包括次氯酸钠，过氧化氢溶液等，但是需要确定适当的接触时间。但是在细菌生物膜内，微生物被包裹在细胞外聚合物（EPS）中，该物质降低了化学消毒剂对微生物的杀灭效果。当使用化学消毒剂的方式时，最重要的是，要确保循环或流动的化学消毒剂不会对整个系统造成不良的负面影响，并且不会污染到其他相邻的系统。任何杀灭生物膜的方法都必须是要根据现场的实际情况来做不同的处理的。

除了对生物膜的微生物进行杀灭，还应考虑生物膜碎片的有效去除，因为这些从不锈钢表面脱落下来的碎片会导致系统中存在的内毒素水平升高，所以，一旦发现生物膜，就要制定有效的去除方式方法来避免可能存在的风险。

很多客户有一个误区，只要纯化水机、注射用水机或分配系统发现微生物限度失控，就认为频繁地启动化学消毒或巴氏消毒程序一定可以解决问题，而实际情况却并非如此，这主要是因为普通化学试剂或巴氏消毒对浮游菌微生物非常有效，对已经形成顽固生物膜的常温制药用水系统并没有太好的效果，一旦系统已经形成了顽固的生物膜，轻则需要启动纯蒸汽消毒或过热水消毒，重则需要采用碱性复合配方清洗剂在高温循环下才能清洗干净。相关的研究表明碱性复合配方清洗剂可以破坏EPS的保护，同时减弱生物膜和物体表面的粘合力作用来使生物膜从表面上脱落。表面活性剂是一类带电荷并具有两亲性质的化合物，会与带负电荷的细菌生物膜相互作用产生灭菌效果。表面活性剂有亲水基团和疏水基团。细胞膜的主要成分是磷脂，在水中表面活性剂靠近细胞膜，然后和磷脂互相溶解，形成疏水基团在里面，亲水基团在外面的球状结构，将其溶解在水中。

例如，使用复合配方的碱性清洗剂（如JClean）来去除生物膜的常用步骤：

①配制一定比例的碱性复合配方清洗溶液（例如：5%）；

②将溶液在系统和所连接的管路中进行循环，温度60-80度，循环时间为1-3小时；

③中和，排放清洗液；

④用纯水或注射用水对整个系统进行冲洗，检测最终淋洗水的pH、电导率、TOC。

关于我们

精川作为致力于为制药行业提供全面且合规的清洗、消毒整体解决方案的服务商，可提供贯穿药品生产（研发-临床-工厂建设-QA/QC-药品制造）全生命周期的服务和产品，我们的愿景是以服务为导向，为客户提供正确的方案及产品，努力提升行业对清洁标准的认知。我们从关键清洗工艺参数的开发到清洁验证，积极配合客户针对生产后的残留物质、生物膜、红锈等顽疾提供合规有效的清洗试剂和解决方案，使客户在解决清洗难题的同时，能满足国内外最新法规对于清洁验证的要求，为药品的稳定生产及质量合规提供夯实的基础。

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